Sie befinden sich hier:

Themen » Untersuchungen » Molekularbiologie


Inhalt

Molekularbiologische Verfahren

Allgemein

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dient dem Nachweis spezifischer Nukleinsäure­sequenzen in verschiedenen Matrices (z.B. Lebensmittel, Pflanzen, Körperflüssigkeiten, Zellkulturen, Organe, Mikroorganismen).

Sie wird im CVUA-RRW für den Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel und Pflanzen verwendet, die Diagnostik von Mikroorganismen in verschiedenen Matrices und den Nachweis der Tierart in Lebensmittel- und Futtermittelproben.

Methodenbeschreibung

PCR (Polymerase-Kettenreaktion)

Vor der Durchführung der PCR werden die in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren mit geeigneten Methoden aus dem vorhandenen Material extrahiert.

Die PCR ist eine temperaturabhängige, zyklisch ablaufende Reaktion, mit der spezifische Nukleinsäuresequenzen schnell und selektiv amplifiziert werden.

Während des dreistufigen Reaktionsablaufes erfolgt im ersten Schritt die Auftrennung der doppelsträngigen DNA (Desoxyribonukleinsäure/deoxyribonucleic acid; Träger der Erb­information) in zwei Einzelstränge. Im zweiten Schritt lagern sich die Primer spezifisch an die komplementäre Zielsequenz an und im dritten Schritt findet schließlich die Synthese (Amplifizierung) der Zielsequenz durch die thermostabile DNA-Polymerase statt. Sie verlängert die an­gelagerten Primer unter Verwendung der dNTP’s (2’-Desoxyribonukleosid-5’-triphosphat, Bausteine der DNA). Pro PCR wird dieser dreistufige Prozess zwischen 30- bis 50-mal wiederholt. Bei jedem Zyklus wird theoretisch die Anzahl der DNA-Kopien verdoppelt.

Agarosegelelektrophorese

In einer Gelelektrophorese wird das entstandene Amplifikat aus der PCR im elektrischen Feld mithilfe eines DNA-bindenden Farbstoffes (z.B. Ethidiumbromid) und ultravioletten (UV)-Lichts sichtbar gemacht.

Die Elektrophorese ist ein biochemisches Trennverfahren, mit dem die Wanderung von geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld zu deren Trennung ausgenutzt wird. Das Verfahren wird sowohl zu analytischen als auch zu präparativen Zwecken eingesetzt. Elektrophoresen werden meist in einer elektrisch neutralen, festen Gelmatrix aus Agarose oder Polyacrylamid durchgeführt. Nukleinsäuren sind aufgrund ihres Zucker-Phosphat-Gerüsts bei allen pH-Werten negativ geladen. Sie wandern daher bei der Elektrophorese zur Anode und das umso langsamer, je größer sie sind.

Restriktionsverdau

Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die DNA innerhalb einer Sequenz schneiden können. Jedes Enzym erkennt dabei eine spezifische DNA-Basensequenz.

Durch unterschiedliche Sequenzen von PCR-Produkten ergibt sich bei der Restriktion mit einem bestimmten Enzym für jedes Produkt ein charakteristisches Schnittmuster, das durch eine Agarosegelelektrophorese erkennbar wird.

Real-Time PCR

Die Real-Time-PCR ist wie die PCR eine temperaturabhängige, zyklisch ablaufende Reaktion, mit der spezifische Nukleinsäuresequenzen schnell und selektiv amplifiziert werden. Im Gegensatz zu einer normalen PCR kann allerdings die Amplifikation der DNA bereits während der Reaktion verfolgt werden.

Die DNA-Amplifikate, die sich während des dreistufigen Reaktionsablaufes bilden, werden mithilfe einer spezifischen Sonde, an die ein Fluoreszenz­farbstoff gekoppelt ist, detektiert. Über die optische Einheit des Real-Time-PCR-Gerätes erfolgt dann die Detektion. Weitere Analysen und Spezifizierungen der PCR-Produkte sind nicht notwendig.

Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR)

Voraussetzung für den Nachweis von RNA aus Untersuchungsmaterial mittels PCR ist die Umschreibung (Transkription) der „gesuchten“ RNA in eine der RNA komplementären DNA (c-DNA). Dies geschieht mit sequenzspezifischen Primern, die an der gesuchten RNA binden und einer reversen Transkriptase oder einem Enzym, das reverse Transkriptase-Aktivität besitzt. Diesen Vorgang des Umschreibens von RNA in c-DNA nennt man reverse Transkription (RT). Die daraus resultierende c-DNA wird in der anschließenden PCR amplifiziert.

Weitere Informationen

Molekularbiologische Verfahren für die Analyse von Lebens- und Futtermittelproben und die Diagnostik von Krankheitserregern

Bestimmung der Tierart

Über zwei verschiedene molekularbiologische Verfahren erfolgt die Bestimmung der Tierart –  zum einen über einen PCR-RFLP (Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus) und zum anderen über tierartspezifische PCRs.

Die PCR-RFLP-Technik wird zur Tierartidentifizierung in rohen und erhitzten Fleisch- und Fischwaren und Tierprodukten angewendet. Voraussetzung für eine Identifizierung der Tierart ist das Vorhandensein von Referenzmaterial der zu bestimmenden Tierart. Für die Analyse wird aus den zerkleinerten Fleischwaren die Gesamt-DNA isoliert. Jede Zelle enthält dabei vielfache Kopien des in der PCR zu vermehrenden DNA-Abschnitts (vertebrales mitochondriales Cytochrom-b-Gen/Cytb-Gen). Der Nachweis erfolgt im ersten Schritt über die PCR-Amplifikation eines Abschnittes des in allen Tierarten vorkommenden cytb Gens. In einem zweiten Schritt wird das PCR-Produkt mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten. Zur Bestimmung der Tierart wird das Restriktionsfragmentlängenmuster der Probe mit den Mustern des Referenzmaterials verglichen. Für die Identifizierung einer Tierart ist eine Übereinstimmung der beiden Restriktionsmuster notwendig.

Die tierartspezifische PCR wird zur Identifizierung und Differenzierung der Tierarten Schwein, Rind, Schaf, Ziege, Huhn und Pute in rohen und erhitzten Fleisch­waren, in Fleischmischungen, Futtermitteln und Tierprodukten angewendet. Im Unterschied zum Tier­artennachweis mittels PCR-RFLP werden hierbei in der PCR Primer eingesetzt, die nur für die betreffende Tierart spezifisch sind und keine Amplifikation mit Sequenzen anderer Tierarten zeigen. Die Tierart wird als nachgewiesen beurteilt, wenn ein spezifisches PCR-Produkt detektiert werden kann.

Detektion von gentechnisch veränderten Organismen (GVO)

Die Detektion von gentechnisch veränderten Pflanzen umfasst Screening-Methoden, konstruktspezifische PCR-Verfahren und eventspezifische Methoden sowie PCRs zum Nachweis der Pflanzenarten.

Mit einem Screening werden z.B. bestimmte genetische Elemente erfasst, die bei der Konstruktion vieler gentechnisch veränderter Pflanzen verwendet wurden. Mit pflanzenspezifischen PCR-Methoden werden spezifisch genetische Elemente von einzelnen Pflanzenarten erfasst, von denen es viele gentechnisch veränderte Linien gibt, z.B. Mais und Soja. Mit konstrukt- und eventspezifischen PCR-Methoden lassen sich im Screening auf­fällige Proben weiter charakterisieren und die vorhandene, gentechnisch veränderte Pflanzenlinie bestimmen.

Je nach Nachweismethode werden dazu konventionelle PCRs oder Real-Time-PCRs ver­wendet.

Bei der Verwendung von Real-Time-PCRs kann der GVO-Gehalt der Probe auch quantifiziert werden. Bestimmt wird dabei der relative Anteil einer für den zu bestimmenden GVO spezifischen DNA-Sequenz im Verhältnis zu einer allgemeinen DNA-Sequenz (z.B. Mais) innerhalb einer Probe.

Nachweis von Mikroorganismen in Probenmaterial von Tieren und Lebensmitteln

Molekularbiologische Methoden haben in den letzten Jahren auch in der Tierseuchendiagnostik und beim Nachweis von Krankheitserregern in Lebensmitteln eine immer größere Bedeutung erlangt. Mittlerweile stehen für viele Tierseuchen wie z.B. die klassische Schweinepest, PCR-Protokolle zur Verfügung, die einen schnellen Nachweis des genetischen Materials von Viren, Bakterien oder Parasiten ermöglichen. Auch für die Untersuchung von Krankheitserregern in Lebensmitteln werden diese Methoden eingesetzt, z.B. bei der Untersuchung von Tupferproben auf Noro- und Rotaviren, die von verdächtigen Lebensmitteln bzw. Gegenständen genommen werden.

Neben dem direkten Nachweis der DNA bzw. RNA aus Untersuchungsmaterial eignet sich die PCR auch für die Erregeridentifizierung aus kulturellen Anzuchten.

Weitere Informationen