Allgemein
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dient dem Nachweis spezifischer Nukleinsäure-sequenzen in verschiedenen Matrices (z. B. Lebensmittel, Pflanzen, Zellkulturen, Organe, Mikroorganismen).
Sie wird im CVUA-RRW für den Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel und Pflanzen verwendet, die Diagnostik von Mikroorganismen in verschiedenen Matrices und den Nachweis der Tierart in Lebensmittel- und Futtermittelproben.
Methodenbeschreibung PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
Vor der Durchführung der PCR werden die in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren mit geeigneten Methoden aus dem vorhandenen Material extrahiert.
Die PCR ist eine temperaturabhängige, zyklisch ablaufende Reaktion, mit der spezifische Nukleinsäuresequenzen schnell und selektiv amplifiziert werden.
Während des dreistufigen Reaktionsablaufes erfolgt im ersten Schritt die Auftrennung der doppelsträngigen DNA (Desoxyribonukleinsäure/deoxyribonucleic acid; Träger der Erb-information) in zwei Einzelstränge. Im zweiten Schritt lagern sich die Primer spezifisch an die komplementäre Zielsequenz an und im dritten Schritt findet schließlich die Synthese (Amplifizierung) der Zielsequenz durch die thermostabile DNA-Polymerase statt. Sie verlängert die an¬gelagerten Primer unter Verwendung der dNTP’s (2’-Desoxyribonukleosid-5’-triphosphat, Bausteine der DNA). Pro PCR wird dieser dreistufige Prozess zwischen 30- bis 50-mal wiederholt. Bei jedem Zyklus wird theoretisch die Anzahl der DNA-Kopien verdoppelt.
Gelelektrophorese
In einer Gelelektrophorese wird das entstandene Amplifikat aus der PCR im elektrischen Feld mithilfe eines DNA-bindenden Farbstoffes (z.B. Ethidiumbromid) und ultravioletten (UV)-Lichts sichtbar gemacht.
Die Elektrophorese ist ein biochemisches Trennverfahren, mit dem die Wanderung von geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld zu deren Trennung ausgenutzt wird. Das Verfahren wird sowohl zu analytischen als auch zu präparativen Zwecken eingesetzt. Elektrophoresen werden meist in einer elektrisch neutralen, festen Gelmatrix wie z. B. Agarose oder Polyacrylamid durchgeführt. Nukleinsäuren sind aufgrund ihres Zucker-Phosphat-Gerüsts bei allen pH-Werten negativ geladen. Sie wandern daher bei der Elektrophorese zur Anode und das umso langsamer, je größer sie sind.
Real-Time PCR
Die Real-Time-PCR ist wie die PCR eine temperaturabhängige, zyklisch ablaufende Reaktion, mit der spezifische Nukleinsäuresequenzen schnell und selektiv amplifiziert werden. Im Gegensatz zu einer normalen PCR kann allerdings die Amplifikation der DNA bereits während der Reaktion verfolgt werden.
Die DNA-Amplifikate, die sich während des dreistufigen Reaktionsablaufes bilden, werden mithilfe einer spezifischen Sonde, an die ein Fluoreszenz¬farbstoff gekoppelt ist, detektiert. Über die optische Einheit des Real-Time-PCR-Gerätes erfolgt dann die Detektion. Weitere Analysen und Spezifizierungen der PCR-Produkte sind nicht notwendig.
Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR)
Voraussetzung für den Nachweis von RNA aus Untersuchungsmaterial mittels PCR ist die Umschreibung (Transkription) der „gesuchten“ RNA in eine der RNA komplementären DNA (c-DNA). Dies geschieht mit sequenzspezifischen Primern, die an der gesuchten RNA binden und einer reversen Transkriptase oder einem Enzym, das reverse Transkriptase-Aktivität besitzt. Diesen Vorgang des Umschreibens von RNA in c-DNA nennt man reverse Transkription (RT). Die daraus resultierende c-DNA wird in der anschließenden PCR amplifiziert.
Weitere Informationen
Molekularbiologische Verfahren für die Analyse von Lebens- und Futtermittelproben und die Diagnostik von Krankheitserregern Bestimmung der Tierart
Die tierartspezifische PCR wird zur Identifizierung und Differenzierung der Tierarten Schwein, Rind, Schaf, Ziege, Huhn und Pute in rohen und erhitzten Fleisch¬waren, in Fleischmischungen, Futtermitteln und Tierprodukten angewendet. Hierbei werden in der PCR Primer eingesetzt, die nur für die betreffende Tierart spezifisch sind und keine Amplifikation mit Sequenzen anderer Tierarten zeigen. Die Tierart wird als nachgewiesen beurteilt, wenn ein spezifisches PCR-Produkt detektiert werden kann.
Detektion von gentechnisch veränderten Organismen (GVO)
Die Detektion von gentechnisch veränderten Pflanzen umfasst Screening-Methoden, konstruktspezifische PCR-Verfahren und eventspezifische Methoden sowie PCRs zum Nachweis der Pflanzenarten.
Mit einem Screening werden z. B. bestimmte genetische Elemente erfasst, die bei der Konstruktion vieler gentechnisch veränderter Pflanzen verwendet wurden. Mit pflanzenspezifischen PCR-Methoden werden spezifisch genetische Elemente von einzelnen Pflanzenarten erfasst, von denen es viele gentechnisch veränderte Linien gibt, z. B. Mais und Soja. Mit konstrukt- und eventspezifischen PCR-Methoden lassen sich im Screening auf-fällige Proben weiter charakterisieren und die vorhandene, gentechnisch veränderte Pflanzenlinie bestimmen.
Je nach Nachweismethode werden dazu konventionelle PCRs oder Real-Time-PCRs ver-wendet.
Bei der Verwendung von Real-Time-PCRs kann der GVO-Gehalt der Probe auch quantifiziert werden. Bestimmt wird dabei der relative Anteil einer für den zu bestimmenden GVO spezifischen DNA-Sequenz im Verhältnis zu einer allgemeinen DNA-Sequenz (z. B. Mais) innerhalb einer Probe.
Nachweis von Mikroorganismen in Probenmaterial von Tieren und Lebensmitteln
Molekularbiologische Methoden haben in den letzten Jahren auch in der Tierseuchendiagnostik und beim Nachweis von Krankheitserregern in Lebensmitteln eine immer größere Bedeutung erlangt. Mittlerweile stehen für viele Tierseuchen wie z. B. die klassische Schweinepest, PCR-Protokolle zur Verfügung, die einen schnellen Nachweis des genetischen Materials von Viren, Bakterien oder Parasiten ermöglichen. Auch für die Untersuchung von Krankheitserregern in Lebensmitteln werden diese Methoden eingesetzt, z. B. bei der Untersuchung von Tupferproben auf Noro- und Rotaviren, die von verdächtigen Lebensmitteln bzw. Gegenständen genommen werden.
Neben dem direkten Nachweis der DNA bzw. RNA aus Untersuchungsmaterial eignet sich die PCR auch für die Erregeridentifizierung aus kulturellen Anzuchten.
Immunologische Verfahren (EIA/ELISA)
Allgemein
Als immunologisches Verfahren zum Nachweis von Proteinen über eine Antikörperbindung werden bei der Bestimmung von Tierarten, bei der Detektion von Allergenen und beim Nachweis von Antikörpern ELISA-Tests verwendet.
ELISA (EIA)
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (enzymgekoppelter Immunadsorptionstest)
Methodenbeschreibung Sandwich-ELISA
Grundlage eines ELISA ist die Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Vertiefungen der verwendeten Mikrotiterstreifen sind mit spezifischen Antikörpern gegen die zu bestimmenden Proteine beschichtet. Durch Zugabe von Standard oder Probe kommt ein Antigen-Antikörper-Komplex zu Stande. In der Probe vorhandenes Protein wird gebunden. Nach ab¬geschlossener Inkubation werden in einem Waschschritt die nicht gebundenen Anteile entfernt. Danach erfolgt die Zugabe eines enzymgekoppelten zweiten Antikörpers. Dieser bindet an die an der Platte fixierten Antigen-Antikörper-Komplexe. Nach erneuter Inkubation und anschließender Auswaschung überschüssiger Reagenzien erfolgt der Nachweis durch Zugabe von Substrat/Chromogen. Das an den Antikörper gebundene Enzym wandelt das Substrat/Chromogen in ein farbiges oder anderweitig zu detektierendes Endprodukt um. Die Zugabe eines Stoppreagenzes führt zu einem Farbumschlag der Reaktion. Die Messung erfolgt fotometrisch.
Werden Standards mitgeführt, kann anhand deren optischer Dichte eine Eichkurve erstellt und damit die Konzentrationen der Probelösungen berechnet werden.
Kompetitiver ELISA
Grundlage ist auch hier die Antigen-Antikörper-Reaktion. Wie beim Sandwich-ELISA ist die Mikrotiterplatte mit spezifischen Antikörpern beschichtet und durch die Zugabe von Standard oder Probe kommt ein Antigen-Antiköper-Komplex zu Stande. Zusätzlich wird allerdings auch ein enzymmarkiertes Antigen zugegeben. Freies (aus der Probe) und enzymmarkiertes Antigen konkurrieren um die spezifischen Antikörper. Nicht gebundenes, enzymmarkiertes Antigen wird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Die Zugabe eines zweiten Antikörpers entfällt. Der Nachweis erfolgt dann allerdings wieder wie beim Sandwich-ELISA durch die Zugabe von Substrat/Chromogen.
Gentechnisch veränderte Organismen
Gentechnisch veränderte Organismen (GVO) dürfen nur dann in bzw. zu Lebensmitteln bzw. Futtermitteln verarbeitet werden, wenn sie zugelassen wurden. Das Zulassungsverfahren beinhaltet auch eine Sicherheitsbewertung des jeweiligen Organismus. Das Lebensmittel darf keine nachteiligen Auswirkungen auf die Gesundheit von Mensch, Tier und Umwelt haben. Siehe Gentechnisch veränderte Organismen.